本文闡述了冷凍光學(xué)顯微鏡圖像的計(jì)算清除技術(shù)如何能夠改善冷凍電子顯微鏡對(duì)細(xì)胞靶區(qū)的識(shí)別。人類已知的疾病很多。為了找到有效的治療方式，必須對(duì)健康和不健康人體當(dāng)中最基本的細(xì)胞機(jī)制予以深入研究。冷凍電子顯微鏡工作流程的最新進(jìn)展使得人們能夠以低于1nm的分辨率來(lái)獲取細(xì)胞蛋白質(zhì)社會(huì)學(xué)的3D數(shù)據(jù)。為提高該工作流程在生成所需數(shù)據(jù)時(shí)的可靠性，冷凍光學(xué)顯微鏡就成為了一個(gè)極其重要的工具，可檢查樣本質(zhì)量，并在冷凍電子顯微鏡內(nèi)對(duì)靶區(qū)部位進(jìn)行常規(guī)識(shí)別，尤其是針對(duì)冷凍斷層成像技術(shù)而言，冷凍光學(xué)顯微鏡尤為重要。我們?cè)诖嗣枋隽死鋬龉鈱W(xué)顯微鏡的圖像質(zhì)量如何獲得改善，以確保對(duì)靶區(qū)部位更為精準(zhǔn)的識(shí)別。

冷凍電子斷層成像工作流程以及冷凍光學(xué)顯微鏡的重要性原因說(shuō)明
許多有關(guān)人體生理學(xué)和病理學(xué)的科學(xué)問(wèn)題只能通過(guò)研究最基本的細(xì)胞機(jī)制才能獲得解答。這些細(xì)胞機(jī)制是所有功能性組織、器官及整個(gè)有機(jī)體的根基。
為了解健康和病理生理學(xué)狀態(tài)下不同細(xì)胞類型的功能發(fā)揮，因此很有必要確定參與功能實(shí)現(xiàn)的生物分子如蛋白質(zhì)等，同時(shí)深入檢查分子水平上的相互作用。
為實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，研究中使用了冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)（Cryo TEM），并以低于1 nm的超高分辨率在細(xì)胞環(huán)境內(nèi)分辨出生物分子。這種方式之下，單獨(dú)的蛋白質(zhì)無(wú)需標(biāo)示就可獲得識(shí)別，“只需"通過(guò)外形就能辨識(shí)。此外，即便在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有不同的構(gòu)造和分布也能加以區(qū)分。

圖1：冷凍電子斷層成像的部分區(qū)域，顯示出細(xì)胞核周圍的原生細(xì)胞環(huán)境。蛋白酶體在兩個(gè)不同的位置與核孔復(fù)合物（紫色）相連（橙色：膜栓系蛋白酶體，黃色：籃狀栓系蛋白酶體，藍(lán)色：游離蛋白酶體）。另外還顯示出了細(xì)胞核包膜（灰色）、核糖體（黑/白）和線粒體（紅色，有一排黃色的ATP合成酶）。感謝德國(guó)馬丁雷德Max Planck生化研究所分子結(jié)構(gòu)生物學(xué)系B. Engel博士提供的圖片。原圖發(fā)表出處：Albert S, Scha?er M, Beck F, Mosalaganti S, Asano S, Thomas HF, Plitzko JM, Beck M, Baumeister W, Engel BD, Proteasomes tether to two distinct sites at the nuclear pore complex, PNAS, December 2017。

作為先決條件，樣本必須使用復(fù)雜精密的技術(shù)（玻璃化處理）來(lái)進(jìn)行冷凍固定以避免破壞性的冰晶形成。與其他固定技術(shù)不同，蛋白質(zhì)要盡可能維持接近于其原生狀態(tài)。此后，薄樣本（小于300nm）即可在Cryo TEM下進(jìn)行直接的評(píng)估。通過(guò)傾斜樣本可創(chuàng)建形成觀察樣本容積的三維數(shù)據(jù)集并進(jìn)行重建，從而獲得感興趣蛋白質(zhì)的3D分布情況（圖2，冷凍電子斷層成像）。

圖2：冷凍電子斷層成像技術(shù)的示意圖。使用電子束（TEM）對(duì)樣本進(jìn)行觀察的同時(shí)，將樣本傾斜以便從不同的觀察角度創(chuàng)建一系列圖像。3D立體結(jié)構(gòu)得到重建，同時(shí)可對(duì)蛋白質(zhì)的分布進(jìn)行可視化觀察和分析。

為了對(duì)樣本“更厚"部分進(jìn)行觀察，必須將樣本減薄。除了冷凍超薄切片技術(shù)外，使用專門的冷凍掃描電子顯微鏡來(lái)進(jìn)行聚焦離子束（FIB）研磨也是一種可選的方法。兩個(gè)離子束窗口的定位應(yīng)確保在感興趣區(qū)域內(nèi)形成厚度大約200 nm的薄冰片（薄層）。通過(guò)這種方式，即便是無(wú)法深入研究的樣本，也能部分接受Cryo ET的觀察（圖3，F(xiàn)IB研磨）。

圖3：聚焦離子束研磨技術(shù)示意圖。使用掃描電子束觀察樣本的同時(shí)，還對(duì)樣本專門使用了聚焦離子束（FIB）以去除薄冰片（薄層）上方及下方的物質(zhì)。

由于整個(gè)工作流程較為冗長(zhǎng)，所需步驟繁多，而EM上的材料和成像時(shí)間又會(huì)帶來(lái)高昂的成本，因此必須及早確定樣本質(zhì)量以及網(wǎng)格上存在的靶區(qū)。此外還有一大挑戰(zhàn)在于找出精準(zhǔn)的研磨位置以確保薄層中含有感興趣蛋白質(zhì)。
要克服這些挑戰(zhàn)，冷凍光學(xué)顯微鏡就成為了整個(gè)工作流程當(dāng)中非常重要的組成部分。使用冷凍光學(xué)顯微鏡即可對(duì)樣本質(zhì)量進(jìn)行檢查，而最為重要的是感興趣結(jié)構(gòu)的位置可以通過(guò)使用基因編碼熒光標(biāo)簽來(lái)加以確定（圖4）。

圖4：靶區(qū)標(biāo)定與檢索。冷凍光學(xué)顯微鏡和FIB SEM中的熒光酵母細(xì)胞。左圖：酵母熒光圖片，其中顯示了紅色的核仁和綠色的細(xì)胞壁。用十字光標(biāo)將核仁標(biāo)記出來(lái)。右圖：在FIB SEM中檢索同樣的位置以便創(chuàng)建出含有感興趣核仁的薄層。此處還顯示了初始研磨階段。薄層（黑色部分）上下研磨窗口可見。比例尺：10µm。感謝Philipp Erdmann博士提供的圖片；酵母莖由德國(guó)馬丁雷德Max-Planck生化研究所F. Wil?ing創(chuàng)建。

這些標(biāo)記可選擇性地查看，并以2D和3D形式揭示出了所有感興趣結(jié)構(gòu)的位置。將熒光圖像和SEM圖像關(guān)聯(lián)起來(lái)就能夠?qū)撛诘难心ゲ课宦?lián)系起來(lái)（關(guān)聯(lián)光學(xué)與電子顯微學(xué)技術(shù)CLEM）。
盡管存在著諸多的挑戰(zhàn)（樣本的安全低溫轉(zhuǎn)移、冰冷部分可能出現(xiàn)的水冷凝、低溫下對(duì)物鏡的使用……），但依然可以使用市售冷凍光學(xué)顯微鏡來(lái)加以克服。

冷凍光學(xué)顯微鏡和去霧處理

徠卡顯微系統(tǒng)提供了專門的冷凍光學(xué)顯微鏡 – 冷凍光電聯(lián)用系統(tǒng)THUNDER Imager EM Cryo CLEM，其中配備了最新的LED技術(shù)和先進(jìn)的高靈敏度科研CMOS攝像頭（圖5）。

圖5：徠卡顯微系統(tǒng)的專用冷凍光學(xué)顯微鏡 – 冷凍光電聯(lián)用系統(tǒng)THUNDER Imager EM Cryo CLEM。

按照一個(gè)軟件工作流程即可在不到1分鐘的時(shí)間里完成整個(gè)樣品臺(tái)（EM網(wǎng)格）的概覽況圖，并對(duì)網(wǎng)格的支撐膜完整性加以檢查。在第二步中則可確定出靶區(qū)熒光信號(hào)的分布，以及后續(xù)FIB研磨的合適區(qū)域位置。

圖6：室溫下THUNDER技術(shù)在Hela細(xì)胞球體上的應(yīng)用

不太令人滿意的是，盡管寬場(chǎng)顯微鏡是一種十分靈敏的技術(shù)而且非常適合冷凍成像，但圖像中依然可以觀察到背景噪聲。這種主要源于樣本焦點(diǎn)外區(qū)域的背景顯著降低了系統(tǒng)的對(duì)比度和潛在信噪比（SNR）。所記錄到的圖像通常會(huì)顯示一層薄霧，而且可能無(wú)法達(dá)到正確定位感興趣結(jié)構(gòu)所需的精細(xì)水平。
為解決這一寬場(chǎng)問(wèn)題，徠卡顯微系統(tǒng)開發(fā)了全新系列的成像系統(tǒng) –THUNDER成像儀，利用計(jì)算清除技術(shù)作為該成像系統(tǒng)的核心技術(shù)。每一次對(duì)圖像進(jìn)行采集時(shí)會(huì)對(duì)焦點(diǎn)外背景進(jìn)行探測(cè)并清除，從而實(shí)現(xiàn)感興趣信號(hào)的直接可用。與此同時(shí)，在焦點(diǎn)內(nèi)區(qū)域當(dāng)中，樣本特征性的邊緣和強(qiáng)度依然得到保留。
尤其對(duì)于生物學(xué)樣本，其背景在整張圖像內(nèi)通常無(wú)法保持恒定，在視野內(nèi)的變化較大。計(jì)算清除技術(shù)可自動(dòng)解決該問(wèn)題，從而實(shí)現(xiàn)焦點(diǎn)內(nèi)信號(hào)的即刻可見。

THUNDER成像儀提供了三種可選的模式：

• 即刻計(jì)算清除（ICC）

• 小體積計(jì)算清除（SVCC）

• 大體積計(jì)算清除（LVCC）

ICC對(duì)應(yīng)以上所述的計(jì)算清除模式。

SVCC和LVCC是計(jì)算清除處理與基于決策掩膜的3D去卷積處理的組合，專用于薄層樣本（SVCC）或厚層樣本（LVCC）。去卷積法的自適應(yīng)圖像信息摘錄遵循的概念是由最初針對(duì)共聚焦顯微鏡而研發(fā)的徠卡顯微系統(tǒng)自適應(yīng)去卷積法LIGHTNING所演變而來(lái)的。

LIGHTNING使用決策掩膜作為基礎(chǔ)參照來(lái)為圖像序列中的各三維像素計(jì)算適當(dāng)?shù)膮?shù)設(shè)定。結(jié)合寬場(chǎng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）后，LIGHTNING的功能即可轉(zhuǎn)移用于寬視野探測(cè)（更多信息可查看這里）。

THUNDER下的分辨率改善

對(duì)單個(gè)無(wú)重疊衍射限定物體運(yùn)用小體積計(jì)算清除（SVCC）時(shí)可使得分辨率增強(qiáng)。在既定示例當(dāng)中對(duì)40 nm直徑的單一珠進(jìn)行了成像（100x放大透鏡，NA 1.44）并使用了SVCC。相關(guān)樣本的結(jié)果為分辨率增強(qiáng)^*，即橫向增強(qiáng)2倍左右（X切面使用SVCC的比率FWHM/原始數(shù)據(jù)=0.51）和軸向增強(qiáng)約2.5倍（Z切面使用SVCC的比率FWHM/原始數(shù)據(jù)= 0.39）。

*由點(diǎn)源發(fā)射光的表觀尺寸定義的分辨率增強(qiáng)。低于衍射限值的兩個(gè)相鄰結(jié)構(gòu)很難彼此分開。

圖7：尺寸小于光學(xué)分辨率限值的單一珠的強(qiáng)度測(cè)量。X軸（左）和Z軸（右）：SVCC前（藍(lán)色點(diǎn)）后（紅色點(diǎn)）。擬合高斯分布（陰影部分）。插圖顯示對(duì)應(yīng)的XY和XZ平面。

由于THUNDER技術(shù)成功在環(huán)境溫度下進(jìn)行樣本成像，因此Leica專家隨后提出了在冷凍條件下運(yùn)用該技術(shù)的想法。寬視野冷凍圖像的去霧處理尤為實(shí)用，因?yàn)檫@種處理不僅能改善圖像質(zhì)量，同時(shí)還可以確保更加可靠地為后續(xù)EM工作流程步驟（即FIB研磨和TEM分析）識(shí)別出感興趣結(jié)構(gòu)。

圖8：THUNDER在冷凍條件下的應(yīng)用。存在核仁標(biāo)記物NOP56::mars（紅色）表達(dá)，并表現(xiàn)出細(xì)胞壁顯著自體熒光（綠色）的釀酒酵母細(xì)胞。左圖：THUNDER使用前z堆棧的圖像投影；右圖：經(jīng)THUNDER-LVCC處理后的圖像。插圖顯示了放大區(qū)域。比例尺：5µm。感謝Philipp Erdmann博士提供的圖像；莖部分由德國(guó)馬丁雷德Max-Planck生化研究所F. Wil?ing創(chuàng)建。

圖8顯示了使用THUNDER技術(shù)（THUNDER LVCC）所觀察到的酵母細(xì)胞。在左側(cè)面板上可以看到，細(xì)胞壁綠色自體熒光的焦點(diǎn)外霧化會(huì)干擾對(duì)核仁的識(shí)別。有人可能認(rèn)為，綠色熒光可以從重疊圖像上移除，但同時(shí)還需要對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行可視化處理才能識(shí)別出核仁并沒(méi)有發(fā)生粘附。運(yùn)用THUNDER以后，背景霧化部分有所減少，同時(shí)又能將信號(hào)保留；細(xì)胞壁與核仁清晰可見，而且也更容易滿足FIB研磨的識(shí)別目的。
在不同樣本上運(yùn)用了THUNDER技術(shù)。圖9顯示了另一項(xiàng)案例：標(biāo)記有綠色熒光染料的A9細(xì)胞與鬼筆環(huán)肽相結(jié)合。鬼筆環(huán)肽選擇性地與纖維肌動(dòng)蛋白相結(jié)合，在真核細(xì)胞當(dāng)中發(fā)揮了結(jié)構(gòu)作用。左圖中的細(xì)微結(jié)構(gòu)被焦點(diǎn)外光線（見箭頭處）所隱藏，但在右圖中經(jīng)過(guò)THUNDER SVCC處理后得以顯示。

圖9：使用Alexa Fluor 488鬼筆環(huán)肽標(biāo)記纖維肌動(dòng)蛋白（F肌動(dòng)蛋白）所標(biāo)示的A9細(xì)胞。THUNDER處理前（左圖）后（右圖）的3D圖像堆棧的投影。THUNDER可清除霧層，甚至最細(xì)微的結(jié)構(gòu)（箭頭處）都變得更清晰可見，因此便于完成靶向標(biāo)定（使用SVCC）。

F肌動(dòng)蛋白很適合進(jìn)行THUNDER成像，因?yàn)樵摰鞍讓儆诒±w維結(jié)構(gòu)，改善效果能夠立即顯現(xiàn)。連同mCherry 標(biāo)示的F肌動(dòng)蛋白，圖10同樣顯示了水泡結(jié)構(gòu)：高爾基體外側(cè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（TGN）中的蛋白質(zhì)TGN46通過(guò)GFP熒光進(jìn)行指示。TGN將新的蛋白質(zhì)指示到不同的亞細(xì)胞目標(biāo)位置。THUNDER技術(shù)在移除掉焦點(diǎn)外光線所產(chǎn)生的模糊影像的同時(shí)，還顯示了這些小水泡結(jié)構(gòu)。

圖10：使用THUNDER SVCC之前（左圖）和之后（右圖）HeLa細(xì)胞采用F肌動(dòng)蛋白染色（mcherry），高爾基體外側(cè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)蛋白TGN46（GFP）以及DNA（Hoechst 33342）。感謝英國(guó)倫敦Francis Crick研究所Marie-Charlotte Domart博士和Lucy Collinson博士提供樣本。

總結(jié)

在本文中，我們利用計(jì)算機(jī)清除技術(shù)證實(shí)了徠卡顯微系統(tǒng)的THUNDER成像技術(shù)如何能夠在冷凍狀態(tài)下改善玻璃化樣本的圖像質(zhì)量。即便是細(xì)微的結(jié)構(gòu)也能通過(guò)去除主要由焦點(diǎn)外光線所形成的霧層或模糊部分來(lái)實(shí)現(xiàn)可視化觀察。THUNDER成像技術(shù)不僅能夠改善圖像質(zhì)量，同時(shí)也有助于更輕松地識(shí)別后續(xù)EM分析步驟所需要的結(jié)構(gòu)。
相關(guān)產(chǎn)品

冷凍光電聯(lián)用系統(tǒng)THUNDER Imager EM Cryo CLEM能夠精準(zhǔn)識(shí)別細(xì)胞結(jié)構(gòu)，同時(shí)能夠通過(guò)關(guān)聯(lián)工作流程來(lái)順暢安全地傳輸坐標(biāo)、圖像和樣本。